自动生化分析技术

自动生化分析技术

50年代以来，由于基础科学，包括物理学、电子学和化学的飞跃发展，新型的分析仪器层出不穷，大大推动了生物化学检验的发展，但由于大多数由人工操作，费时费力，且误差较大，可重复性较小。到60年代中期，各种生化自动分析仪相继问世，可在一个小时内将上百个们品测定20个项目以上，大大提高了工作的效率。80年代以来，各种生物化学测定，如血糖、尿素、肌酐、蛋白质、血乳酸等干片法的出现，又使生物化学检验从离不开试剂的“湿生化”过渡到不需要水的“干生化”。这些新出现的方法和仪器为我们运动员的身体机能评定以及全民健身的科学化进行提供了更多的选择余地，使我们更好地满足运动员机能评定所需要的及时、灵敏、方便、准确的需要。

1、自动生化分析的性能与应用

所谓自动化分析仪就是将生化分析中的取样、加试剂、混合、保温反应、检测、结果计算、书写报告以及清洗等步骤的部分或全部由模仿手工操作的仪器来完成。它完全模仿并代替了手工操作，不仅提高了工作效率，而且减少了主观误差，稳定了检验质量。自动生化分析仪可进行定时法、连续监测法等各种反应类型的分析测定。除了一般生化项目测定外，有些还可进行激素、免疫球蛋白、血药浓度等一些特殊化合物的测定以及酶免疫、荧光免疫等分析方法的应用。由于这类仪器一般都具有简便、灵敏、准确、快速、节省、标准化和微量等优点，使得生化自动分析仪在生物学的生化分析中得到了广泛应用。

2、生化自动分析仪的发展史及类型

自50年代Skeggs首次介绍一种临床生化分析仪的原理以来，随着科学技术尤其是医学科学的发展，各种生化自动分析仪和诊断试剂均有了很大发展，根据仪器的结构原理不同，可分为连续流动式（管道式）、分立式、离心式和干片式四类；根据自动化程度可分为半自动生化分析仪和全自动生化分析仪。新型的自动分析仪常装有：样品识别、自动加样、自动检测、数据处理、打印报告和自动报警等装置。

(1)管道式分析仪

管道式分析仪的特点是测定项目相同的各待测样品与试剂混合后的化学反应，是在同一管道中经流动过程完成的。将几个单通道管道式分析仪结合，对一个样品同时测定几个项目。著名的有12通道分析仪，命名为顺序多项自动分析仪，简称SMA12/60。

（2）分立式分析仪

所谓分立式，是指按手工操作的方式编排程序，并以有节奏的机械操作代替手工，各环节用送带连接起来，按顺序依次操作。分立式分析仪与管道式分析仪在结构上的主要区别为：前者各个样品和试剂在各自的试管中起反应，而后者是在同一管道中起反应；前者采用由采样器和加液器组成的稀释器来取样和加试剂，而不用比例泵；前者一般没有透析器，如要除蛋白质等干扰，需另行处理。恒温器必须能容纳需保温的试管和试管架，所以比管道式分析仪的体积要大。除此之外，其它部件与管道式的基本相似。

（3）离心式分析仪

离心式分析仪是1969年以后发展起来的一种分析仪，由Anderson设计，其特点是化学反应器装在离心机的转子位置，该圆形反应器称为转头，先将样品和试剂分别置于转头内，当离心机开支后，圆盘内的样品和试剂受离心力的作用而相互混合发生反应，最后流入圆盘外圈的比色槽内，通过比色计检测。这类分析仪特点是（1）在整个分析过程中，各样品与试剂的混合、反应和检测等每一步骤，几乎都是同时完成的，不同于管道式和分立式分析仪的“顺序分析”，而是基于“同步分析”的原理而设计。（2）样品量和试剂量均为微量级（样品用1-50μl，试剂120-300μl），快速分析（每小时可分析600个样品以上）。（3）转头是这类分析仪的特殊结构。

（4）干片式分析仪

干片式分析仪是80年代问世的。首先Eastman Kodak公司以其精湛的化学工艺造出了测定血清中血糖、尿素、蛋白质、胆固醇等的干式试剂片。当加上定量的血清后，在干革命片的背面产生颜色反应，用反射光度计检测即可进行定量。这类方法完全革除了液体试剂，故称干化学法。

（5）半自动生化分析仪

半自动生化分析仪指在分析过程中的部分操作（如加样、保温、吸入比色、结果记录等某一步骤）需手工完成，而另一部分操作则可由仪器自动完成。这类仪器的特点是体积小，结构简单，灵活性大，既可分开单独使用，又可与其他仪器配套使用，价格便宜，一般在分立式分析仪中多常见。这类仪器一般不受试剂、方法的限制，国产试剂、自己配制的试剂及自行设计的方法均可在仪器上进行检测，而且由于仪器的体积小、重量轻、操作方便、反应迅速，尤其适合中、小型检验单位作为是常生化检测的主要仪器，也适用于作急诊生化检测及外出执行任务时使用。

（6）全自动生化分析仪

全自动生化分仪，从加样至少出结果的全过程完全由仪器自动完成。操作者只需把样品放在分析仪的特定位置上，选用程序开动仪器即可等取检验报告。由于分析中没有手工操作步骤，故主观误差很少，且由于该类仪器一般都具有自动报告异常情况，自动效正自身工作状态的功能，因此系统误差也较小，给使用者带来很大的便利。这类仪器的功能全，灵活性大，易于操作，大多采用吸光度、荧光、光散、浊度测定技术和离子选择电极系统，用于常规生化、特殊蛋白和药物监测等检测，可随机安排程序，既可根据需要输入单一项目成批分析，又可按临床医生根据患者病情不同要求，选择性的多项组合分析；结果报告既能打印出每个项目的报告，也能按人打印出所做全部项目的累积报告。

以上自动化分析仪虽有几种分类，但由于自动生化分析仪是模仿手工操作的过程，故无论哪一类型的自动生化分析仪，其结构组成均与手工操作时的一些器械设备相似，一般可由以下几个部分组成：（1）样品器，放置待测样品、标准品、质控液、空白液和对照液等；（2）吸样结构，吸样探针及输送样品的管道；（3）稀释器或试剂管道、吸取、分配和输送试剂；（4）反应池或反应管道；（5）保温器；（6）比色皿（管）；（7）检测器（比色计、分光光度计、荧光分光光度计、火焰光度计、电化学测定仪等）；（8）微处理机或程序控制器；（9）打印机或记录仪；（10）功能监测器等。

3、生化自动分析仪的性能评价与合理选用

目前，临床生化自动分析仪的规格型号很多，生产厂也很多，随着技术革新和应用的要求，在性能和结构上都有了很大改进和发展。正确评价与合理选用这些仪器十分重要。

（1）自动化程度高

对一台生化分析仪来说 ，自动化程度越高，说明仪器功能越强。仪器的自动化程度高低取决于仪器所使用微处理机的功能大小，根据仪器计算机功能的不同，自动化分析仪一般可分为全自动和半自动两种。全自动分析仪比较适合于样品量多，化验项目多，检验更简便迅速；半自动分析仪的一部分操作由手工进行，但也较省时、省力。

（2）分析效率

这里的分析效率，系指在测定方法相同的情况下不同分析仪的分析速度。对不同类型的分析仪，由于其结构和设计原理的不同，微机应用程度不同造成自动化程度的差异。也直接影响到分析仪的分析效率。

（3）应用范围

自动生化分析仪的应用范围包括可测试的生化项目、其它项目、反应的类型及分析方法的种类等。应用范围广的分析仪不仅能测多种生化检验指标，而且还可进行药物监测和各种特异蛋白的分析、微量元素测定等。分析方法除了分光光度法外，还能进行浊度比色法、离子选择性电极法、荧光法等测定。既能用终点法，又可用动态法测定。它可使酶免疫技术、固相酶技术得以应用，从而在科研和技术生产开发工作中，发挥更大的效益。有些分析仪采用了独特的双波长光路设计，可消除“背景噪声”，排除样品中溶血、脂血及胆红素等成分的干扰，精确灵敏，在一些特殊的测量分析中很有用。

（4）分析准确度

生化分析仪测量的准确度愈高愈好。准确度取决于各部件(加液、温控、波长、记时等)的加工精确度及其精确的工作状态。如有的分析仪采用样品液体感应探针，准确吸样，使样品携带率低于0.5%，不仅能准确地吸取微量样品，而且还能充分混合样品及试剂，使测量结果精确度提高。另外，克服分析仪中交叉污染，也是保证测定结果准确的重要环节。生化分析仪一般对取样探针有自动清洗装置，从而保证测试结果的准确率。

4、生化自动分析的原理及方法

生化分析常用方法根据其测定的原理可作如图1分类。一类方法是物理方法，测定是物质固有的物理特性。另一类是物理化学方法，也就是将所测定物质一些化学转化后再进行测定。动态法是在所测定的物质浓度在不断变化中，由传感器获得相应的改变的信号进行计算的方法。平衡法是由传感器得到相对不变的信号进行计算的方法。现在越来越多被临床生化应用的酶试剂方法，无论是用自动分析仪记录或分光光度计或普通比色计都包括在动态法的范围内。

1.平衡法(终点法)

这类方法的特点是被测物质(酶反应的底物)在酶反应过程中应完全被转化或消耗掉，即达到反应的终点。通常这类方法操作简单，一般不需要作标准管，通过一些已知的理化常数，例如克分子吸光系数等不难将结果计算出来。其缺点是反应时间较长，特别不适合于离心式自动分析仪。还有少数酶反应，底物并未完全消耗掉，只是达到一个动态平衡，此时，往往需要同时作标准管。

2.动态法

动态法在自动分析仪中的应用十分广泛，但是动态法的分类一直比较混乱。一般可分为可变信号法和固定信号法两类。

可变信号法：直接法即根据所得到的吸光度变化直接计算结果：由于对所收集数据多少有很大意义，所以又区分为一点法、二点法、多点法。一点法是在一个预先设置时间测定各个标本吸光度。二点法则是在一点法基础上多测一点，即在酶反应仍未进行时的吸光度和一点法相比可以通过空白测定扣除这部分误差，但是仍无法了解反应过程，避免不了延缓期或非线性反应所引起的误差。

固定信号法：测定原理是随着反应进行，通过不断添加试剂使吸光度变化在很窄范围内，此时所测的是加试剂的量，并依此来计算物质浓度。最典型例子是以对硝基酚作为指示剂的乙酰胆碱酯酶方法，在反应过程中不断加入碱以中和酶水解产物乙酸以维持pH不变，然后根据所加碱量计算酶含量。这一类方法由于操作费时麻烦，目前应用很少，但不应忘记这类方法能维持瓜条件如pH的恒定性，其它如在NADH参与的反应中不断加入NADH硼于避免底物的消耗，在一些特殊情况下可能还是有用的。

3.固定时间法(二点法)

固定时间法在自动分析仪中的应用，有助于我们解决反应的特异性问题，最明显的例子就是苦味酸法测肌酐和溴四甲酚绿法测白蛋白。人们早就知道很多物质如维生素C、乙酰醋酸、葡萄糖、果糖以及某些药物也能和苦味酸呈色。近年来发现这些干扰物质呈色较慢，提出用自动生化仪只测定开始一分钟的反应，明显提高了苦味酸法测肌酐的特异性。用溴甲酚绿测白蛋白法，此法由于简单易行，在70年代取代了经典的盐析法，但随即发现一部分球蛋白如ɑ球蛋白也能和溴甲酚绿结合，但这类反应比较迟，所以目前更多地使用自动分析仪测定开始一分钟的反应来计算白蛋白量。

4.空白对照方法

由于使用了各种高新技术，在自动生化分析仪中人们可以根据实际情况，使用各种空白和对照方法。

1.固定法空白 ①试剂；②标本+盐水；④标本+灭能试剂； ⑤标本+完全试剂(时间不同)；

2.动态法空白 ①试剂空白；②标本+空白试剂。

从理论上说固定空白法用“标本+完全试剂”是最好的办法，可以扣除各种因素的误差，如试剂、比色杯等，这也是在自动生化仪应用较多的方法，而用手工法是不易做到的。动态空白仅用于少数试剂不稳定方法。

五、自动生化分析仪使用时注意事项

使用时应注意：

①大多使用固定的比色池，结果的重复性比较好，但由于检测方法、所加试剂及样品量都很少，因此要特别注意取样和加试剂的准确性。

②如反复出现非线性（NL）大于10%，应考虑试剂是否变质及所编程序是否合适。

③在作动力学方法检测时，要注意实验的反应原理，如果是吸光度下降的应在浓度因数（F）值的前面加负号，否则结果不准。做酶动力学方法检测时，还要注意开始的吸光度（Ai），如果特别低可能由于样品中酶活力较高，在延迟时间内基质已被消耗完。此时，必须把样品进行稀释后在进行检测。

④出现仪器不吸液体，常常由于仪器长时间不用，吸液管被压扁而堵塞，只要稍加揉擦即可畅通，如管道由于不及时清洗而造成的堵塞，这就要进行清洗或更换。

⑤在使用过程中，严禁吸入强酸试剂，否则将会损坏吸管的金属头，每次使用完毕，都必须用蒸馏水冲冼比色池和管道，如果在反复多次吸入蒸馏水后，不能调整零点，应用清洁液浸泡比色池。具体操作是将温度放在37Co,用10%清洁液（detergent）充满比色池，浸泡15分钟，再用水冲洗。仪器长时间不用，应在一个月内通电一次，否则仪器内程序的记忆即消失。

六、RT-1904C型半自动生化分析的使用

RT-1904C是一台网络化的生化分析仪器，适应性广泛，各种不同检验项目只需改变试剂、改变程序即可，可以单个样品同时进行几个项目检测，也可多样品平行作不同项目检测。其基本原理：有色物质对光的吸收定律称为朗伯-比耳定律，由朗伯定律和比耳定律合并而得，因有色物质的浓度、液层厚度与其对光吸收的强度之间存在定量关系。

RT-1904C型半自动生化分析仪器简介

（1）RT-1904C是一台网络化的生化分析仪器。可用于测定：

电解质（Electrolytes）

基质(Substrates)

酶类(Enzymes)

血浆蛋白类(Plasmaproteins)

激素类(Hormones)

血液凝固检查(Coagulation)

药物浓度检查(TDA‘S)

（2）可编程160个检验项目。所有测定项目的原始设定程序，均可由使用者修改。

（3）具有双比色系统：流动比色池系统和比色杯系统。

（4）可提供下列测试方法

终点反映法(Endpoint)

速率法

固定时间二点法(Fixed time)

双波长测定(Bichromatie)

动力学法(Kinetics)

吸光度测定(Absorbance)

多点效准曲线法(Multi-Calibration)

（5）可进行血清、血浆、全血及。尿液等样品的分析

（6）可与医院内部网络、质量监测中心及雷杜用户服务中心连网，为工作带来极大的便捷。

（7）可选用内置打印机或外置打印机。

（8）可选配外置标准键盘、CRT显示器、鼠标或条码扫描仪。

七、RT-1904C型半自动生化分析仪常用测试项目

（1）酶类：GGT? L-Υ-谷氨酰移换酶、ALT 谷丙转氨酶、CK-NAC 肌酸激酶、AST 谷草转氨酶、HBDH 羟丁酸脱氢酶、LDH-L 乳酸脱氢酶-L 、AMS 淀粉酶、LDH-P 乳酸脱氢酶-P 、ACP 酸性磷酸酶、ALP 碱性磷酸酶、CK-MB 肌酸激酶-MB同工酶

（2）代谢物质：GLU 葡萄糖、CHOL 胆固醇、HDL-C 高密度脂蛋白胆固醇、TRIG 甘油三脂、TBILI 总胆红素、DBILI 直接胆红素、UREA 尿素、CR 肌酐、UA 尿酸、TBA 总胆汁酸、LPS 脂肪酸

（3）蛋白类物质： Hb 血红蛋白、TP 总蛋白、ALB 白蛋白、IgG 免疫球蛋白G、 IgA 免疫球蛋白A 、IgM 免疫球蛋白M 、ApoA 载脂蛋白A 、ApoB 载脂蛋白B 、LP(a) 脂蛋白 (a)、LDL 低密度脂蛋白、PALB 前白蛋白、ApoE 载脂蛋白

（4）电解质：Na 钠 、CI 氯、Ca 钙、Mg 镁、K 钾、IRON 铁、IP 无机盐、Cu 铜、Zn 锌、 TIBC 总铁结合率

（5）小分子物质：C3 补体C3 、C4 补体C4

八、RT-1904C型半自动生化分析仪基本操作步骤

（1）开机，待机器自行检测稳定，并吸蒸馏水自行检测比色池。

（2）程序设置：RT-1904C程序设置包括了检测方法、项目名、单位、温度、波长、空白、延迟时间、测度时间、样本量、试剂量、吸液量、正常参考值范围、因子、标准、质控等内容。仪器的固定测试项目设置：在自检完成后，自动进入固定测试项目菜单。测试项目共有160个单元，其中47个是最常用项目，所有项目均由用户自行定义，最多允许设置100个项目。用户已经设置的项目均在窗口中列表显示，关机时自动保存。

（3）样品测试

（4）综合报告