免疫组织（细胞）化学

免疫组织（细胞）化学的概念

免疫组织（细胞）化学（immunocytochemistry ,ICC），简称免疫组化，是将抗原、抗体间的免疫反应引入组织(细胞)标本，并通过对抗体（或抗原）所带有的特殊标记物的显示，藉以完成对组织（细胞）内某抗原（或抗体）的定性、定位以及定量检测。

免疫组织（细胞）化学的应用

免疫组织（细胞）化学最突出的优点，就是它在更广阔的范围内，把结构和功能及代谢结合起来。能在微观世界原位地决定组织及细胞结构的化学成分，达到了方法统一、定性可靠、定位准确、定量可能的境界，是形态学不再是静止的形态描述，而被赋予了功能和代谢的含义。它的微细、原位而又方法统一的优点是任何一种化学方法所不能取代的。

研究内容

（一）细胞和组织中本来存在的物质，参与自身结构的成分；

（二）从体外自然引入的物质，如病理变化产生的或不同生理状态下产生的；

（三）对人为引入的物质成份进行实验性追踪。

因为具有以上优点，被广泛应用于科研中。

免疫组化标的基本原理：

数码照相3幅图示

PAB法

ABC法

LABC或称为SABC,SP法

免疫组化标准化的染色方法：

    1.取材，固定，脱水，浸蜡，包埋，做成石蜡切片

    2.将石蜡组织切片粘贴在防脱玻片上;

    3.切片二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水至水化;

    4.如果需要，缓冲液冲洗，抗原修复处理(热抗原修复或酶消化);

    5.灭活内源性过氧化物酶的活性，缓冲液冲洗;

    6.血清封闭孵育，缓冲液冲洗;

    7.加载相应的一抗，孵育，缓冲液冲洗;

    8.加载对应的二抗，孵育，缓冲液冲洗;

    9.加载相应的酶结合物孵育，缓冲液冲洗;

  10.加载对应的酶底物，显色，复染，脱水，封片，观察。

免疫组化染色技术的标准化

    在免疫组织化学实验中，每个实验室常选择不同的检测系统，实验技术操作方法亦不尽相同，所以做好一张满意的免疫组化切片也并非轻而易举，突出的问题是每次实验结果的稳定性与重现性较差，原因在于免疫组织化学是一项技术性很强的实验方法，它还没有可以适合于所有实验室和所有抗体的唯一实验方法。但随着免疫组化的厂泛应用与实验室间日益密切的信息与技术的交流，免疫组化技术的焦点已经集中在了对其标准化实质性问题的探讨上。免疫组化标准化的讨论目前是建立在辣根过氧化物酶(HRP)检测方法基础上而进行展开的。

(一)染色前(Preanalytlc or Pre-Stain)处理因素

    1、取材、脱水、浸蜡

    免疫组化要求组织离体后应立即固定，理想的取材厚度是2mm，组织在脱水机中的处理条件应十分妥当，大量的实验室经验公认在加热抗原修复过程中组织脱片的主要原因是取材过厚以及脱水浸蜡处理不当所致。如果H&E切片尚做不出满意的染色结果，那么免疫组化染色也将无从谈起，根本无法保证染色质量。

    2、福尔马林固定

众多组织固定液中，在保持组织细胞结构的完整性、抗原可测定性、组织渗透性以及试剂的价格上，福尔马林都是首选的。在免疫组化中首选的固定液是10%中性福尔马林液(市售甲醛1:9稀释)，福尔马林固定引起的组织抗原决定簇的封闭与交联可以通过抗原修复方法来修正，为确保离体组织的抗原性，值得高度重视的是离体组织须马上固定，组织离体后，固定一般不要超过15分钟，固定在常温条件下时间为8一24小时，同时还要注意的重要一点是要避免福尔马林过度固定造成的组织抗原损失，有研究发现新鲜组织经过福尔马林一周固定后组织抗原丢失严重，抗原几乎不能被检出。

    3、包埋与切片

    固定后的组织，在过热或高温的石蜡中包埋容易导致抗原的破坏，因为石蜡熔液是非缓冲体系，尤其对固定条件不佳的组织影响更大，需选用低熔点的石蜡。切片的厚度在4-5μm，过厚的切0片，不仅容易脱片，还影响免疫反应及镜下观察。

    4、脱蜡

    免疫组化的脱蜡步骤与常规H&E脱蜡步骤相同，免疫组化实验室中脱蜡需完全干净，最佳的方法是与H&E常规脱腊分开以保证脱蜡彻底，否则可能导致染色结果的异常。二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水至水化。

(二)免疫组化实验中的抗原修复

    目前在免疫组化实验中，抗原修复是影响染色结果的最关键因素，抗原修复方法有多种，但经过多年实验室的实验验证大多数实验室采用的是酶消化法与加热抗原修复两种方法。

   1、酶消化法

    酶消化法是最早的抗原修复方法，消化酶的作用在于能够暴露因组织固定而导致的抗原决定簇的封闭，以增强染色效果。消化酶有多种，如胰酶、DNase、蛋白酶K、胃酶等等，现只有少数的抗体可以选择酶消化的方法。由于热抗原修复方法的厂泛使用，酶消化方法在免疫组织化学方法中的应用已越来越少。

2、加热抗原修复(Heat Induced Epitope Retrieval  HIER)

    加热抗原修复最初1 991年由Shi等报导，已经经过了10多年大量实验室的实验验证，加热处理后免疫组化的染色敏感度大幅度地提高，其机理推测可能是加热打开了组织抗原福尔马林固定所引起的抗原决定簇的交联，但机理目前仍然还不是十分清楚。某些研究表明组织中钙结合(或其他二价阳离子)也可能是重要的影响因素。

有报道，ER,PR染色偏弱的原因，是由于微波加热时间不足与实验中操作控制不当所致，故强力推荐使用高压抗原修复方法。对高压法、微波法、水煮法进行对照实验，染色强度的实验对照结果是:高压法>水煮法>微波法。同时对9例ER、PR进行微波和高压抗原修复实验方法对照实验，结果显示:高压法的实验重现性与染色强度均优于微波法。

（三）背景染色及其它干扰因素

有许多因素可以影响免疫细胞染色结果,其中最主要的因素为:内源性过氧化物酶活性及背景染色包括非特异性免疫染色及非特异性交叉反应。

1、 内源性过氧化物酶活性(endogenousperoxidaseactivity):

红细胞内的假过氧化物酶(pseudoperoridase),中性粒细胞内的髓过氧化物酶(myeloperoxidase),酸性正铁血红素(acidhematin),嗜酸性细胞、单核细胞内的过氧化物酶等都可以与二氨基联苯胺（DAB）反应产生棕色反应物。这种棕色反应物与特异性免疫反应不易区分。由于甲醇-过氧化氢可以使组织抗原变性(Denaturation),所以在免疫染色前将内源性过氧化物酶封闭,可以减少或清除这种染色的干扰,一般用3%甲醇-过氧化氢处理30～40分钟(室温),或用1%硼氢化钠处理20～30分钟(室温)。

2、非特异性免疫染色(undesirablenonspecificim-munologicstaining):

在鉴别组织抗原的免疫细胞化学染色的常规固定及制样过程中,非特异性免疫染色是一个主要的干扰。在胶原结缔组织中最易产生,使背景深染而与周围抗原的对比减弱。这种非特异性背景染色的原因很多,但首要的是应在未滴加一抗前用不同种动物的正常动物血清处理。它有两种功能,其一可以提供白蛋白,与组织内的非特异性蛋白结合,另外因所含的天然抗体,不与一抗反应,也可达到上述效果。固定不充分也是一个主要因素,可以使抗原从原位弥散造成非特异性免疫染色。

3、 非特异性交叉反应染色(undesirablespecificstaining)：

有多种原因可导致非特异性染色,主要是从非待检抗原而来和一抗的非特异性。因此使用高亲合力的抗体,可保证高特异性及减少或消除非特异性交叉反应(crossreactivity)。用低稀释度抗体使天然抗体与组织抗原有效竞争,从而增加了非特异性染色,所以使用高稀释度的抗体是减少非特异性染色最有效的方法。使用高稀释度抗体并延长孵育时间可进一步提高染色效果,神经免疫细胞化学染色有时孵育长达4～5日(4℃)。总之,用最高稀释度抗体和延长孵育时间是可获得满意结果的方法。此外,为了使抗体与抗原充分结合,在染色前用净化剂TX-100浸渍。即在未加一抗前用0.4%TX-100/0.1mol/LTBS处理5～6分钟或在一抗内加入0.3%TX-100都可使通透性增加。对提高染色效果及正确评估染色结果都具有重要意义